ПЦР количественный: зачем и как проводится.

ПЦР: что это такое? Диагностика инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции

Информацию из данного раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. В случае боли или иного обострения заболевания диагностические исследования должен назначать только лечащий врач. Для постановки диагноза и правильного назначения лечения следует обращаться к Вашему лечащему врачу.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР, PCR) изобрёл в 1983 году Кэри Мюллис (американский учёный). Впоследствии он получил за это изобретение Нобелевскую премию. В настоящее время ПЦР-диагностика является, одним из самых точных и чувствительных методов диагностики инфекционных заболеваний.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).

В основе метода ПЦР лежит многократное удвоение определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). В результате нарабатываются количества ДНК, достаточные для визуальной детекции. При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце.

Кроме простого увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификацией), ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК), и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, введения мутаций, выделения новых генов.

Специфичность и применение

ПЦР – метод молекулярной диагностики, ставший для ряда инфекций «золотым стандартом», проверен временем и тщательно апробирован клинически. Метод ПЦР позволяет определить наличие возбудителя заболевания, даже если в пробе присутствует всего несколько молекул ДНК возбудителя.

ПЦР позволяет диагностировать наличие долго растущих возбудителей, не прибегая к трудоёмким микробиологическим методам, что особенно актуально в гинекологии и урологии при диагностике урогенитальных инфекций, передающихся половым путем (ИППП).

    Исследование урогенитального тракта методом ПЦР на ИППП ;

Выявление ДНК хламидий, гонококка, трихомонады, микоплазмы гениталиум, вируса простого герпеса 1-го и 2-го типов, цитомегаловируса в урогенитальном соскобе используется для подтверждения инфицированности при наличии клинических признаков воспаления урогенитального тракта, для дифференциальной диагностики урогенитальных инфекций.

    тест методом ПЦР на коронавирус Covid-19, мазок из носа и зева на определение РНК вируса SARS-CoV-2;

• Определение РНК вируса SARS-CoV-2 (все виды известных штаммов, включая Delta и Omicron)
• Производитель – АО Вектор-Бест
• Возможен предварительный заказ на сайте
• Справка о результатах анализа на русском и английском языках
• Справка выдается только при отрицательном результате исследования!

Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и скрыто существующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях.

Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов. Методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва и т. д.). В урологической и гинекологической практике – для выявления хламидиоза, уреаплазмоза, гонореи, герпеса, гарднереллёза, микоплазменной инфекции, ВПЧ – вирусов папилломы человека; в пульмонологии – для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний, туберкулёза; в гастроэнтерологии – для выявления хеликобактериоза; в клинике инфекционных заболеваний – в качестве экспресс-метода диагностики сальмонеллёза, дифтерии, вирусных гепатитов В, С и G; в гематологии – для выявления цитомегаловирусной инфекции, онковирусов.

Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами – короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18 – 30 букв. Каждый из праймеров сопоставим (комплементарен) с одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка.

После соединения (гибридизации) матрицы с праймером (отжиг), последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы.

Проведение ПЦР

Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

  • ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать;
  • два праймера, комплементарные концам требуемого фрагмента;
  • термостабильная ДНК-полимераза;
  • дезоксинуклеотидтрифосфаты (A, G, C, T);
  • ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы;
  • буферный раствор.

ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1°C. Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Добавление специфичеких ферментов может увеличить выход ПЦР-реакции.

Ход реакции

Обычно при проведении ПЦР выполняется 20 – 35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94 – 96°C (или до 98°C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5 – 2 минуты, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией — разрушаются водородные связи между двумя цепями. Иногда перед первым циклом проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2 – 5 минут для полной денатурации матрицы и праймеров.

Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от праймеров и обычно выбирается на 4 – 5°С ниже их температуры плавления. Время стадии — 0,5 – 2 минут.

ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия элонгации. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы наиболее активны при 72°C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 10 – 15 мин.

Подготовка материала к исследованию и транспорт его в лабораторию

Для успешного проведения анализа важно правильно собрать материал у пациента и правильно провести его подготовку. Известно, что в лабораторной диагностике большинство ошибок (до 70%) совершается именно на этапе пробоподготовки. Для взятия крови в лаборатории ИНВИТРО в настоящее время применяются вакуумные системы, которые с одной стороны минимально травмируют пациента, а с другой – позволяют произвести взятие материала таким образом, что он не контактирует ни с персоналом, ни с окружающей средой. Это позволяет избежать контаминации (загрязнения) материала и обеспечивает объективность анализа ПЦР.

ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота – биологический полимер, один из двух типов нуклеиновых кислот, обеспечивающих хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов. Основная роль ДНК в клетках — долговременное хранение информации о структуре РНК и белков.

РНК– рибонуклеиновая кислота – биологический полимер, близкий по своему химическому строению к ДНК. Молекула РНК построена из тех же мономерных звеньев – нуклеотидов, что и ДНК. В природе РНК, как правило, существует в виде одиночной цепочки. У некоторых вирусов РНК является носителем генетической информации. В клетке играет важную роль при передаче информации от ДНК к белку. РНК синтезируется на ДНК-матрице. Процесс этот называется транскрипцией. В ДНК имеются участки, где содержится информация, ответственная за синтез трех видов РНК, различающихся по выполняемым функциям: информационной или матричной РНК (мРНК), рибосомальной (рРНК) и транспортной (тРНК). Все три вида РНК тем или иным способом участвуют в синтезе белка. Однако информация по синтезу белка содержится только в мРНК.

Нуклеоти́ды – основная повторяющаяся единица в молекулах нуклеиновых кислот, продукт химического соединения азотистого основания, пятиуглеродного сахара (пентозы) и одной или нескольких фосфатных групп. Нуклеотиды, представленные в нуклеиновых кислотах, содержат одну фосфатную группу. Они называются по содержащемуся в них азотистому основанию – адениновый (A), содержащий аденин, гуаниновый (G) – гуанин, цитозиновый (C) – цитозин, тиминовый (Т) – тимин, урациловый (U) – урацил. В состав ДНК входят 4 типа нуклеотидов – A, T, G, C, в состав РНК также 4 типа – A, U, G, C. Сахаром в составе всех нуклеотидов ДНК является дезоксирибоза, РНК – рибоза. При образовании нуклеиновых кислот нуклеотиды, связываясь, образуют сахаро-фосфатный остов молекулы, по одну сторону которого находятся основания.

Праймер – котроткая ДНК, используемая для репликации матричной цепи. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка.

  1. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. — М.: Мир, 2002. — 589 с., илл. ISBN 5-03-003328-9
  2. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия — Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2004. — 496 с.; илл. ISBN 5-94087-098-8
  3. Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы — М.: Наука, 2005 — В 2 т. — ISBN 5-02-033278-X
  4. http://ru.wikipedia.org/wiki
ВАЖНО!

Информацию из данного раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. В случае боли или иного обострения заболевания диагностические исследования должен назначать только лечащий врач. Для постановки диагноза и правильного назначения лечения следует обращаться к Вашему лечащему врачу.

ПЦР-тестирование: как работает метод ПЦР в диагностике

ПЦР – высокоточный метод диагностики и одно из самых главных открытий в области биологии за последние десятилетия. ПЦР-анализ применяется уже почти 40 лет и считается наиболее точным и чувствительным способом диагностики инфекционных заболеваний.

ПЦР – уникальный и универсальный метод, тест используется не только в клинической лабораторной диагностике, но также в биологии, криминалистике, археологии и многих других научных областях. Все, что нужно для проведения анализа – небольшое количество любого биоматериала пациента.

Суть метода ПЦР

ПЦР – полимеразная цепная реакция. Метод основан на обнаружении даже небольших концентраций искомого элемента диагностики. Для определения изначально крайне малых концентраций РНК или ДНК, которые необходимо определить в процессе проведения основного этапа исследования, используется метод искусственного увеличения количества РНК или ДНК. А поскольку они специфичны и строго индивидуальны для каждого микроорганизма или живого существа за счет уникальности последовательности нуклеотидов во фрагментах, ошибка в определении целевого ДНК или РНК исключена.

Генетическая информация любого живого организма записывается в ДНК. Эта молекула состоит из двух цепочек, сплетающихся в единую спираль. Некоторые вирусы (например, COVID-19) хранят свой код в РНК – одной нити нуклеотидов.

Для каждого организма, включая вирусы, бактерии и грибки, последовательность нуклеотидов уникальна. Ее можно сравнить с отпечатком пальца или сканом сетчатки глаза человека. Укороченные последовательности нуклеотидов, характерные для каждого вида патогена (возбудителя опасных заболеваний), хранятся в базах научных лабораторий в виде праймеров – отдельных участков ДНК, типичных для только конкретного возбудителя. Эти участки значительно короче любой молекулы ДНК. Такие праймеры присоединяются к ДНК возбудителя в пробе и под действием катализаторов многократно воспроизводят свои дубли. Этот процесс называются «репликация» – многократное увеличение, дублирование искомого участка до тех пор, пока он не станет доступен для определения. Процесс репликации возможен только при наличии в пробе ДНК возбудителя.

Преимущества метода ПЦР

  1. Высокая специфичность. Метод ПЦР определяет заданную последовательность нуклеотидов, присущую конкретному патогену. Таким образом, специфичность теста стремится к 100%. Исключен риск ложноположительных результатов.
  2. Чувствительность. Для ПЦР достаточно всего несколько молекул ДНК патогена (или даже уже неактивных – разрушенных вирусных частиц, сохранивших специфические участки ДНК в достаточном количестве), чтобы он был обнаружен в ходе исследования.
  3. Скорость проведения. Лаборатория получает результат ПЦР-теста через несколько часов, клиент – уже на следующий день. Скорость диагностики имеет принципиально важное значение для своевременного лечения. Например, при диагностике бактериальных инфекций классический посев занимает от нескольких дней, а с ПЦР-анализом пациент сможет принять меры и начать лечение уже через сутки.
  4. Универсальность. Для исследования подходит любой биоматериал: кровь, моча, сперма, мокрота, гной, жидкости из абсцессов и пр. Кроме этого, ПЦР применяется в самых разных областях науки и медицины, работая даже там, где другие методы бессильны.
  5. Диагностика латентных инфекций. ПЦР-диагностика определяет возбудителя инфекции даже в инкубационном периоде и при скрытом течении заболевания.

Какие есть недостатки

Единственный серьезный недостаток, связанный с методом полимеразной цепной реакции, – его высокая технологичность. Исследования ПЦР требуют строжайших соблюдений правил и серьезной оснащенности лабораторного комплекса. Не каждая лаборатория может позволить себе все необходимое оборудование.

Показания к проведению ПЦР-анализа

  • Диагностика инфекционных заболеваний (гепатит, ВИЧ, TORCH-инфекции и огромное множество других видов патогенов).
  • Урогинекология (диагностика инфекций, передающихся половым путем: хламидиоз, уреаплазма, микоплазма, кандиды, гарднерелла, герпесвирусы). Важное значение для женского и мужского здоровья играет ВПЧ – вирус папилломы человека. Доказано, что у женщин онкогенные штаммы этого вируса способны вызывать рак шейки матки.
  • Неонатология. Существует целый ряд инфекций, способных поражать плод еще в материнской утробе. Среди них вирусы герпеса, токсоплазмы, краснухи. ПЦР-диагностика позволяет правильно определить тактику ведения и риски внутриутробной инфекции.
  • Респираторные заболевания. Диагностика методом ПЦР стала в 2020 году актуальной как никогда и продемонстрировала свою незаменимость и эффективность. ПЦР-анализ – главный тест и «золотой стандарт» диагностики коронавирусной инфекции Sars-Cov-2 (COVID-19), ставшей причиной самой масштабной пандемии последних десятилетий.
  • Генетика. Наследственные заболевания и отцовство также диагностируются при помощи метода ПЦР.

Подготовка к проведению ПЦР-теста

  • Анализ сдается утром натощак. При этом ряд генетических исследований проводится в произвольное время, удобное пациенту.
  • При сдаче анализа по мазку из ротоглотки необходимо выдержать интервал с приемом пищи и воды в 3-4 часа перед тестом.
  • Перед анализом на венерические инфекции необходимо воздержаться от половой активности в течение суток.
  • Перед анализом нельзя использовать никакие противовирусные препараты.

Как проводится ПЦР-анализ

  1. С обратной транскрипцией. Самый распространенный способ идентификации известной последовательности РНК, включающий амплификацию, определение патогена и его идентификации среди образцов, хранящихся в научной картотеке.
  2. Вложенная ПЦР (или «гнездовая») — используется для снижения количества неспецифичных продуктов реакции и имеет две стадии с использованием двух видов праймеров.
  3. Изотермические методы – не требуют повторяющихся температурных циклов, менее энергозатратны.
  4. Инвертированная ПЦР — применяется, если имеется только короткий фрагмент известной последовательности, но необходимо определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном.
  5. ПЦР в реальном времени — метод, позволяющий определить не только присутствие целевой нуклеотидной последовательности в образце, но и измерять количество ее копий после каждого цикла амплификации, что дает возможность для проведения тестов с количественным результатом

Результаты ПЦР-теста

Результаты анализов, проведенных методом ПЦР, известны уже через один день. Иногда возможно проведение экстренного теста – его часто используют при оказании срочной медицинской помощи при госпитализации. Тогда срок готовности результата сокращается до считанных часов.

Читайте также:  Виды риса, польза и вред

Результаты ПЦР-теста дадут точную информацию о том, какая инфекция была обнаружена. При количественном тестировании анализ определит также вирусную или бактериальную нагрузку на организм. В этом случае в результатах будет значиться титр обнаруженного патогена (его количество в одном миллилитре пробы). Количественный анализ особенно важен при диагностике заболеваний, спровоцированных условно-патогенными микроорганизмами, которые присутствуют в норме практически у каждого человека. Такие микроорганизмы представляют угрозу только при большой численности, а в остальных случаях мирно сосуществуют с носителем.

Основы количественной и цифровой ПЦР. Применение в практике. Подходы к выбору технологии и реактивов. Часть 1. Суть и аппаратное обеспечение количественной ПЦР

Суть и аппаратное обеспечение количественной ПЦР

(на основе выступления менеджера по развитию бизнеса кПЦР компании Thermo Fisher Scientific Алексея Пазилина)

  • Решения для генетического анализа
  • Thermo Fisher Scientific: краткая характеристика производителя
  • ПЦР в реальном времени
    • Области применения кПЦР
    • Приложения для кПЦР
    • Реализация технологии кПЦР («реал-тайм»)
    • Устройство приборов для технологии «реал-тайм»
    • Программное обеспечение для технологии «реал-тайм»
    • Калибровка приборов
    • Пассивный краситель и его функция

    Решения для генетического анализа

    Сегодня для решения задач генетического анализа существует несколько направлений – NGS, КЭФ, кПЦР («реал-тайм»).

    Практика показывает, что пока нет технологии, которая бы в равной степени успешно решала все задачи, и нет прибора, который бы делал все подряд.

    Определенные задачи решаются с помощью дорогостоящего NGS, но в таком случае потребуется много образцов для запуска, чтобы стоимость анализа за одну точку оказалась адекватной. При этом нужно помнить, что чувствительность NGS не всегда достаточна.

    Для подтверждения NGS нужно капиллярное секвенирование; если есть какие-то готовые SNP («снипы») или нужно посмотреть экспрессию отдельных генов, то проще это делать по технологии «реал-тайм». А если нужно посмотреть много точек или образцов, то приходят на подмогу микрочипы.

    Thermo Fisher Scientific: портфолио

    Thermo Fisher Scientific: краткая характеристика производителя

    Это глобальная компания с большим оборотом, которая продолжает приобретать другие компании в своей сфере деятельности. На сегодня она представлена несколькими дивизионами. Один из них – Life Solutions Group – «Группа по науке о жизни», которая является продолжением Life Technologies [Corporation], Invitrogen, Applied biosystems и так далее. И представляемые ею бренды зарекомендовали себя в течение долгого времени: ThermoScientific, Applied biosystems, Invitrogen, Gibco, Iontorrent.

    В их состав входит множество микробрендов, которые в свое время являлись самостоятельными компаниями.

    Так, в 2020 г. оформили бренд Affymetrix (одноименная компания была куплена в 2015 г.) по производству микрочипов. Теперь это Applied Biosystems. В 2020 г. компания QIAGEN (Кайджен) начала путь к тому, чтобы стать частью Thermo Fisher.

    До середины 2021 г., когда сделка по покупке этой компании закроется официально, QIAGEN и остальная часть Thermo Fisher функционируют как разные организации, Thermo Fisher не продает существующую продукцию QIAGEN и не вмешивается в его бизнес, т.е. до закрытия сделки оборудование QIAGEN продает тот, кто продавал его прежде.

    Thermo Fisher представляет на рынке много продукции и покрывает его примерно на 80%.

    ПЦР в реальном времени

    ПЦР в реальном времени

    Количественная ПЦР – она же «реал-тайм ПЦР», кПЦР – это технология, позволяющая автоматически детектировать амплификацию на каждом цикле без участия оператора и каких-либо рисков.

    У «реал-тайма» огромное количество преимуществ по сравнению с «классической» ПЦР.

    • Главное из них – это формат, в котором можно вести обработку. Это важно с точки зрения производительности лаборатории. Например, классический ПЦР на элекрофорезе позволяет использовать скорее всего 96-луночные планшеты, максимум – с 384 лунками, это неудобно. В «реал-тайме» можно подключать и 384-луночные планшеты, и OpenArray формат – собственную технологию от Thermo Fisher.
    • Динамический диапазон «реал-тайма» существенно больше, чем в электрофорезной классической ПЦР.
    • Меньше и рисков для персонала в силу отсутствия необходимости окрашивания нуклеиновой кислоты бромистым этидием – канцерогеном.
    • «Реал-тайм» демонстрирует большую производительность и требует меньших затрат времени.
    • Удобство и возможность автоматизации процесса (без участия самого оператора)

    Области применения кПЦР

    • «Реал-тайм» в первую очередь применяется для генотипирования, которое на сегодня везде активно ведется с точки зрения анализа нуклеотидных полиморфизмов, однонуклеотидных делеций и инсерций;
    • Анализ метилирования;
    • Анализ экспрессии и определение копийности генов;
    • Анализ трансгенности (прикладное значение: анализ на отсутствие ГМО);
    • Анализ на определение химеризма в медицине (в частности, посттрансплантационного);
    • Качественный и количественный анализ ДНК в криминалистике, что очень востребовано в настоящее время;
    • Контроль качества (например, контаминационный контроль – в пищевом, фармацевтическом производстве и т.д.)
    • Количественное и качественное определение патогенов в инфектологии – молекулярная диагностика, которую проводит огромное количество компаний в связи с появлением новой коронавирусной инфекции в частности;
    • Биобезопасность – опять же с точки зрения контроля качества различных продуктов.

    По сути «реал-тайм» и стандартная ПЦР – это одна и та же система, только туда добавлены еще зонды. Но «реал-тайм» рассчитана на небольшой фрагмент с количеством нуклеотидов от 90 до максимум 250. Поэтому в данном случае стоит говорить о детекции, но не об амплификации длинных фрагментов.

    Приложения для кПЦР

    Если говорить о направлениях и отраслях, где применяется кПЦР, нужно назвать:

    • Персонализированную медицину (фармакогеномику) различного рода – здесь используются «снипирование», генотипирование, анализ копийности генов;
    • Изучение наследственных заболеваний – здесь тоже используются «снипирование» – SNP генотипирование;
    • Разработку лекарственных средств – анализ экспрессии микроРНК и матричных РНК, анализ «переваривания» (метаболизма) лекарственных веществ и работу цитохромов, генотипирование;
    • Ассоциацию биомаркеров с различными заболеваниями (в данном случае тоже важна экспрессия мРНК и микроРНК);
    • Исследования, посвященные инфекционным заболеваниям, в частности качественный анализ, связанный с ними;
    • Сельскохозяйственные технологии: немаловажная роль и в этой отрасли в последние несколько лет отводится генотипированию, качественному анализу, анализу экспрессии генов.

    Реализация технологии кПЦР («реал-тайм»)

    Для проведения кПЦР необходимы:

    2 – управляющий компьютер или компьютер, на котором происходит анализ;

    3 – программное обеспечение, которое позволяет работать с этим оборудованием.

    Устройство приборов для технологии «реал-тайм»

    Амплификаторы для технологии «реал-тайм» имеют классическую оптическую систему, состоящую из:

    • Источника возбуждения;
    • Системы зеркал;
    • Системы линз;
    • Планшета, где происходит возбуждение флуоресценции и ее эмиссия;
    • Детектора.

    Приборы могут различаться типами источника и детектора, но суть остается неизменной: получить результат и детектировать возникновение флуоресценции в каждой отдельной пробирке.

    Программное обеспечение для технологии «реал-тайм»

    Программное обеспечение для технологии «реал-тайм»

    Программное обеспечение для этой технологии делится на две части.

    Первичное – то, на котором можно видеть результаты флуоресценции, логарифмические кривые или линейные графики;

    Вторичное – позволяет производить оценку, расшифровку этих данных в зависимости от цели:

    • В инфектологии отображается «плюс-минус» – качественное определение инфекции;
    • В случае генотипирования – это генотипирующие программы, которые позволяют разводить аллели, экспрессионные программы, программы для анализа копийности генов и так далее.

    Калибровка приборов

    У некоторых приборов, в частности, у Thermo Fisher Scientific, есть калибровки. Иногда производители говорят, что калибровать приборы не нужно, но это не совсем так, что отражено даже в инструкциях.

    Почему это важно?

    1. По району интереса

    Калибровка приборов

    Картинка справа: чтобы прибор позиционировался правильно над лункой и происходило снятие флуоресценции из центра лунки, нужно учесть подвижность частей прибора. Снимать флуоресценцию следует из центра, а не из других точек, иначе произойдет искажение данных.

    1. Калибровка по фону. Часто прибегают к различным приемам, чтобы фона не было, например, использование различного пластика по цвету. Важно убрать фоновую флуоресценцию.
    2. Калибровка по чистому красителю. Важный момент: никто не предлагает калибровать по краскам, заявляя, что прибор откалиброван на заводе. Приборы действительно откалиброваны изначально под какие-то краски, но не под все. Но возникновение флуоресценции и ее гашение у разных красок происходит совершенно по-разному: некоторые умещаются в определенный спектр, а некоторые краски «фонят» и дают сигнал на другом спектре.

    В связи с этим получается «подкрест каналов», когда один канал светит на другой. Этого можно избежать, откалибровав под ту краску, с которой вы работаете, прибор, который вы используете. Прибор будет «видеть» спектр вашей краски и использовать его правильно для дальнейших расчетов.

    Это могут не все приборы, и это не у всех заложено в программном обеспечении. Особенно такие моменты важны для лабораторий, работающих на готовых тест-системах, а не синтезирующих себе зонды с определенными красками самостоятельно.

    Например, почти у всех производителей российских тест-систем второй канал, светящийся в красках HEX, VIC, JOE – называемый желтым или зеленым – использует краску R6G. Прибор «не знает», как светится краска R6G, которая там используется – он откалиброван под другие красители. Есть вероятность, что эта краска может «зайти» на другие каналы, хотя это редкость.

    На приборах QuantStudio от Thermo Fisher калибровку не стали убирать, хотя она всего лишь рекомендованная – раз в два года. Но ее стоит делать просто для того, чтобы пользователи приборов получали нормальные результаты. Доказательство пользы калибровки – успешная работа исследователей, использующих старые приборы серии 7500 и не желающие переходить на другие амплификаторы: результаты, которые они получают на своих 7500, получаются качественными, хотя в приборах используются галогеновые лампы, требующие калибровки каждые полгода(!). Кроме того, если прибор куда-либо перевезли или хотя бы переставили с места на место, целесообразно провести хотя бы калибровку по снятию данных по лункам, просто раскапав воду – это не займет много времени.

    Пассивный краситель и его функция

    Пассивный краситель и его функция

    Особенность приборов Thermo Fisher Scientific, которая присутствовала еще в одной марке оборудования, уже снятой с производства – применение пассивного красителя.

    Многие производители пишут, что без него можно обойтись, так как пассивный краситель только помогает исправить неправильный оптический путь, связанный с ламповидным освещением планшета. На деле это не так.

    • Помогает сглаживать ошибки пользователя, происходящие в момент пипетирования. Они происходят, когда нужно много раз капать (и присутствует человеческий фактор);
    • Сглаживает эффект от наличия пузырьков в пробирке;
    • Помогает сглаживать всплеск флуоресценции, когда по каким-то причинам пробирку встряхнули и капли оказались на стенке, а потом в процессе нагревания они падают на дно, и при этом происходит всплеск флуоресценции;
    • Помогает бороться с испарением – если пробирка закрыта неплотно и пойдет испарение.

    На слайде отображены результаты, полученные на машине BIO-RAD, на нашем оборудовании и с референсным красителем: с красителем картинка нагляднее. Впрочем, это не обязательная опция. В качестве референсного красителя можно использовать любую краску.

    ПЦР-диагностика

    Полимеразно-цепная реакция (ПЦР) – это одно из самых ярких достижений в сфере молекулярной биологии. Метод получил широчайшее распространение в разных областях науки. Благодаря очень высокой специфичности и чувствительности, метод ПЦР применяется в медицине, биологии, ветеринарии, криминалистике, санитарной службе и других отраслях деятельности человека.
    Для анализа методом ПЦР можно использовать любые биологические материалы, которые содержат нуклеиновые кислоты (молекулу ДНК или РНК).

    Принцип ПЦР- исследования

    У каждого живого существа, по крайней мере, на нашей планете, есть уникальный «отпечаток» – ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота), которая отвечает за передачу наследственных факторов от предков к потомкам. Структурно эта молекула представляет собой две нити из молекул-азотитых оснований, удерживаемые рядом друг с другом химическими связями и скрученные в спираль (считается, что для компактности). Из курса биологии вы можете помнить такие названия, как аденин (А), гуанин (Г), тимидин (Т) и цитозин (ц). Это 4 нуклеотида, которые и создают последовательность ДНК. Вирусы хранят свою генетическую информацию в другой нуклеиновой кислоте – РНК.
    Информация об уже изученных ДНК и РНК хранится в научных базах лабораторий. После того, как был изобретен метод ПЦР, для многих возбудителей различных заболеваний (бактерии, грибки и вирусы) были созданы свои специфические генетические детекторы (праймеры) – уникальные последовательности нуклеотидов, характерных только для конкретного возбудителя. И если поместить их в пробирку с исследуемым материалом, при наличии в нем ДНК или РНК «живых» возбудителей, праймеры запускают реакцию репликации – создания огромного числа копий, которое можно идентифицировать визуально. Т.е. они начинают копировать свою ДНК/РНК десятки раз.
    И при подсчете результатов сотрудники лаборатории могут понять, есть ли искомые бактерии и вирусы в исследуемом образце, или нет, именно поэтому результаты ПЦР чаще всего качественные, т.е. «обнаружено» или «не обнаружено».

    Кому мы обязаны появлением метода ПЦР?

    Со слов американского биохимика Керри Мюллиса (Kary Mullis), идея идентифицировать живые организмы по короткому участку их генетического кода (ДНК) пришла ему в голову в 1983 году, по пути с работы домой. А в основе этой идеи, лежала работа другого американского биохимика, Артура Корнберга (Arthur Kornberg), которая в свое время не нашла отклика у научного сообщества.

    Керри допустил возможность того, чтобы взять молекулу ДНК какого-либо организма, с помощью высокой температуры «распустить» ее спираль на две нити, специфическими маркерами-праймеры пометить уникальные для этого микроорганизма участки ДНК и затем, применив фермент ДНК-полимеразу, создать из двух нитей две новые молекулы ДНК. Но уже содержащие в себе меченные праймеры. И потом останется просто искать эти участки в диагностическом материале.

    В итоге, корпорация CETUS, в которой работал Мюлис, выделила ему команду ученых. И в 1985 году, в издании Американского общества генетики человека, появилась публикация с теоретическим обоснованием ПЦР, как метода идентификации генетического материала живых организмов.

    Как это все происходит в лаборатории

    pcr-LQ2.jpg

    Выделение ДНК

    Сначала пробу биологического материала подготавливают: центрифугируют, осаждают и т.д. Затем лаборантам необходимо выделить ДНК из полученного биологического концентрата.
    Амплификация (увеличение числа копий ДНК)
    Важнейший этап исследования. Проводится в термоциклере и именно здесь проходят все процессы, подпадающие под определение полимеразно-цепная реакция: денатурация, отжиг, элонгация.
    Денатурация
    Самый первый этап – развернуть (денатурировать) нуклеиновые кислоты, чтоб сделать их доступными для дальнейшей работы. Осуществляется путем нагрева реакционной смеси до 80-90 °C.
    Отжиг
    Денатурированные (распущенные) ДНК/РНК обрабатывают праймерами – изготовленными в лабораторных условиях коротенькими цепочками нуклеиновых кислот. Благодаря запрограммированному участку, праймеры прикрепляются только к тем нуклеиновым кислотам, для которых были созданы. Например, праймер для вируса простого герпеса 1 типа, никогда не свяжется с ДНК другого вируса, микроорганизма или клетки.
    Именно праймеры обусловливают крайне высокую специфичность ПЦР – способность реагировать только на нуклеиновые молекулы конкретных типов, видов классов и даже штаммов микроорганизмов. Или отдельные виды клеток живых организмов.

    Элонгация

    Или синтез. После завершения процесса отжига, в реакционной смеси создают условия для активности полимеразы. Фермент, ориентируясь на молекулы праймеров (а не исходных нуклеиновых кислот), начинает синтез новых ниток ДНК/РНК. Которые становятся копиями исходных, искомых молекул нуклеиновых кислот.
    Такой температурный цикл проводится 30 и более раз. В результате, даже при изначально небольшом количестве искомого генетического материала, в реакционной смеси накапливается значительное число «помеченных» праймерами нуклеиновых кислот (растет экспоненциально, с удвоением при каждом цикле).Обнаружить большие количества ДНК/РНК намного проще, за счет чего реализуется еще одно преимущество ПЦР – высочайшая чувствительность.

    Детекция

    Оценка результатов ПЦР проводится несколькими путями:

    1. Электрофорез в вязкой среде. Суть в том, что ДНК/РНК заряжены электрически и движутся к одному из электродов. В среду (агар или полиакридный гель) добавляют краситель ДНК (например – бромистый этидий). В процессе сеанса электрофореза, молекулы нуклеиновых кислот движутся и формируют скопления, подкрашенные этидием. Под ультрафиолетом, это выглядит в виде полосок разной толщины и яркости.
    2. Метод гибридизации. Используются праймеры, заранее помеченные люминофором (флуорофором). После нужного числа температурных циклов, применяют специальный прибор – детектор флюоресценции. За счет того, что в образец можно добавлять флуорофоры для разных мишеней (они будут и светиться под ультрафиолетом разным цветом), метод гибридизации подходит для диагностики сразу нескольких мишеней в одном образце.
    3. ПЦР диагностика в реальном времени (real-time PCR). Отличается тем, что детекция проводится прямо в процессе амплификации. Для этого нужны зонды-люминофоры (из предыдущего пункта) и специальные приборы ДНК-амплификаторы. Эти устройства оценивают нарастание яркости люминофора после каждого температурного цикла и впоследствии, вычисляют исходное число искомых нуклеиновых кислот в образце.

    Преимущества методики ПЦР

    Всего разработано более 10 разных методик амплификации, применяемых лабораториями в зависимости от исходных условий и поставленных целей.
    Общим для них есть высокая чувствительность (для положительного результата достаточно 40 (!) или менее искомых копий ДНК в 1 мл образца, то есть вероятность ложноотрицательного ответа ничтожно мала. И очень высокая специфичность: вероятность ложноположительного ответа составляет менее 1%.
    Но точность результатов сильно зависит от качества сбора диагностического материала, тщательного соблюдения всех технических требований к каждому этапу и качеству оборудования, расходных материалов (буфера, праймеров, раствора для отмывки и т.д.).

    pcr-01LQ.jpg

    Области применения в медицине

    В дерматовенерологии ПЦР используют для выявления венерических заболеваний: микоплазменной, хламидийной инфекций, сифилиса, генитального герпеса и др.
    Инфекционисты активно используют ПЦР для диагностики туберкулеза, ВИЧ, вирусных гепатитов, герпеса, мононуклеоза, вируса Эпштейн-Барр и др.). А с помощью ПЦР в реальном времени, оценивая вирусную нагрузку, врачи могут составить мнение о динамике заболевания, отклике на лечение, что особенно актуально для пациентов с ВИЧ, принимающих терапию.
    Также благодаря ПЦР врачи могут в течение нескольких дней с уверенностью идентифицировать коклюш и паракоклюш, выявить возбудителей эпидемии ОРВИ. Уточняются типы вируса гриппа, циркулирующие на определенной территории, на основании чего появляется возможность разработать эффективную вакцину для каждого сезона гриппа.
    В течение суток или быстрее можно установить вид возбудителя кишечной инфекции, а значит – назначить адекватное лечение и обнаружить вероятный источник заражения.
    Летом, ПЦР актуальна для диагностики заболеваний, передаваемых иксодовыми клещами: боррелиоза (болезни Лайма), клещевых энцефалитов.
    Метод позволяет работать с любым биологическим материалом. Гемотрансмиссивные инфекции (сифилис, ВИЧ, гепатиты, боррелиоз) исследуются по пробе венозной крови или спинномозговой жидкости. Кожные болезни (герпес, грибки) – по соскобу с пораженного участка. Венерические и урологические – по образцу мочи, спермы, влагалищного отделяемого.
    Так что в медицине, ПЦР применяется везде, где нужна высокая точность и быстрота получения результатов.

    Анализ ПЦР — самый точный анализ на инфекции

    Анализ ПЦР — самый точный анализ на инфекции

    Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это современный инструмент диагностики разнообразных инфекций, отличающийся высокой точностью. Анализ ПЦР позволяет определять возбудителей инфекционных заболеваний, опираясь на их генетический материал (РНК или ДНК). Биологическим материалом для исследования может служить кровь, мазок из половых органов, слюна и прочее.

    Метод ПЦР был открыт в 1983. Его создатель Кэри Мюллис (США), за это открытие получил Нобелевскую премию в области химии. Уже за первые десять лет методика стала обязательным лабораторным исследованием во всем мире, получив признание ученых и врачей.

    Анализ ПЦР в клинике ДИАНА

    Медицинский центр Диана предлагает провести исследование по методике полимеразной цепной реакции в кратчайшие сроки и с высочайшим уровнем точности. Наша диагностическая база соответствует всем международным стандартам и требованиям.

    Какие инфекции можно диагностировать методом ПЦР

    На диагностику отправляют гинеколог, уролог или дерматолог. Анализ ПЦР дает возможность диагностировать большое число разнообразных инфекций. В эту группу попадают и скрытые, бессимптомные заболевания, находящиеся в инкубационном периоде:

    С помощью метода ПЦР можно обнаружить:

    • гепатит C, B;
    • уреаплазмоз половых органов;
    • ИППП – уреаплазмоз, трихомониаз, гарднереллез,;
    • хламидиоз половых органов и дыхательных путей;
    • микоплазмоз половых органов и дыхательных путей;
    • бактериальный вагиноз;
    • кандидоз половых органов;
    • инфекционный мононуклеоз;
    • туберкулез;
    • сальмонеллез;
    • туберкулез (легочные и внелегочные формы);
    • листериоз, клещевые энцефалиты, болезнь Лайма;
    • цитомегаловирусную, папилломавирусную, герпесную инфекцию;
    • детские заразные болезни, выявляемые при беременности и до зачатия — краснуху, паротит, дифтерию, корь;
    • ВИЧ.

    При каждом из вышеперечисленных заболеваний, обнаруженным другим методом, желательно делать и ПЦР — исследование. Возбудители многих инфекций имеют несколько типов (штаммов), а более точная диагностика делает лечение эффективнее. Поскольку разные типы возбудителей обладают своими способами передачи инфекции, точное определение возбудителя помогает уберечь от заражения окружающих. Например, гепатитом А можно заразиться через общие предметы и посуду (болезнь грязных рук), а гепатитом С — только через кровь, медицинские инструменты и половые контакты. Это важно для тех, кто находится рядом с больным.

    Суть метода полимеразной цепной реакции

    Метод основан на выявлении возбудителя по участкам ДНК или РНК. ПЦР напоминает криминалистику, когда преступника находят по частичкам кожи или волосам, оставленным на месте преступления. Поскольку каждый живой организм имеет уникальную структуру ДНК или РНК. Метод позволяет безошибочно идентифицировать микроорганизм, даже если он присутствует в исследуемом материале в минимальных количествах.

    ПРЦ подходит для выявления скрытого носительства, нетипичных, стертых и прочих форм заразных заболеваний. Диагностика отличается высокой точностью, поэтому практически не дает ошибок и ложных результатов. Анализ часто назначается, как дополнительное обследование, чтобы выявить конкретный тип вируса или микроба.

    Достоинства и недостатки метода ПЦР

    Анализ ПЦР – результативный диагностический инструмент, позволяющий врачу не только правильно определить тип инфекционного возбудителя в организме больного, но также и количество микробов. Эта особенность позволяет методу ПЦР эффективно обнаруживать и хронические инфекции, к примеру, вирусный гепатит.

    Преимущества методики заключаются в следующих особенностях:

    • Универсальность . Метод дает возможность определить все известные на сегодняшний день микроорганизмы, вне зависимости от вида исследуемого материала.
    • Специфичность . ПЦР позволяет определить ДНК вируса или бактерии со 100% точностью, что не дает ни один другой способ диагностики.
    • Чувствительность – даже один мельчайший «обломок» ДНК или РНК может быть обнаружен и идентифицирован, благодаря быстрой реакции образования копий.
    • Оперативность – поставить диагноз на основании полимеразной цепной реакции можно уже через несколько часов после забора биологического материала, что дает возможность своевременно приступить к лечению заболевания.
    • Возможность проведения количественного анализа . Эта особенность важна при выявлении болезней, вызванных условно-патогенной флорой (например, молочницы). Повышенное содержание грибков кандида в организме вызывает заболевание, а нормальное количество до 10 3 — 104 КОЕ/тамп. – нет.

    Недостатки ПЦР-диагностики – это необходимость в высокотехнологичном оборудовании и высококвалифицированных специалистах. Для анализа нужен специальный бокс-ламинар, где поддерживается необходимая температура и обеспечивается чистота эксперимента.

    Как сдать анализ ПЦР правильно: подготовка

    Чтобы понять, как именно следует подготовиться к предстоящему анализу ПЦР, пациент должен обязательно уточнить у своего врача, какой именно биологический материал планируется взять. От этого непосредственно зависит подготовка.

    • Выделения из половых органов, мазок из шейки матки или мочеиспускательного канала, моча – посредством исследования данных вариантов материала методом ПЦР эффективно диагностируются инфекции половых органов.
    • Вирусный гепатит C, ВИЧ инфекция требуют взятие крови на анализ ПЦР.
    • С помощью мазка из зева можно подтвердить или опровергнуть факт наличия инфекционного мононуклеоза.

    Мазок у женщин

    Для диагностики половых инфекций методом ПЦР у женщин, как правило, берут мазок из влагалища . При беременности действуют стандартные правила подготовки к анализу ПЦР.

    • За пару дней до проведения ПЦР нужно отказаться от спринцеваний, средств интимной гигиены.
    • За неделю до анализа на инфекции стоит перестать применять любые виды лекарственных препаратов, разумеется, если они не входят в программу подготовки к анализу ПЦР, прописанную врачом.
    • За пару дней до обследования нужно начать воздерживаться от полового акта.
    • Подмывание в день анализа ПЦР не нужно, гигиена половых органов проводится накануне вечером, используется только теплая вода.
    • За пару часов до сдачи анализа мочиться нельзя.

    Мазок у мужчин

    Подготовиться к забору мазка из мочеиспускательного канала для проведения ПЦР несложно. Достаточно соблюдать изложенные ниже правила.

    • За 2 суток до ПЦР обследования нужно начать воздерживаться от сексуальных отношений.
    • Прием лекарств прекращается приблизительно за 7 дней до проведения анализа, если, конечно же, они не были специально назначены врачом.
    • Гигиена половых органов должна проводиться накануне вечером, в день анализа ПЦР это делать не стоит.
    • Рекомендуется не мочиться примерно 2-3 часа перед сдачей анализа.

    Анализ крови

    Если в процессе ПЦР анализа объектом изучения станет кровь пациента, правила подготовки к нему следующие.

    • Оптимальное время для сдачи крови – утро, анализ нужно обязательно сдавать натощак (минимум 8 часов отсутствия пищи). Воду можно пить свободно.
    • Отказ от алкоголя за сутки до ПЦР анализа, отказ от курения за час до него.
    • Если здоровье допускает такой вариант, от приема лекарственных средств рекомендуется на время отказаться.
    • Перед сдачей проб крови в обязательном порядке следует отдохнуть около 20 минут.
    • Накануне ПЦР исследования совершенно исключены эмоциональные и физические перегрузки, они могут сказаться на результатах анализа.

    Как проводится тест ПЦР?

    Для исследования берется любая среда, в которой может находиться возбудитель, но чаще всего используются:

    • Кровь сыворотка или плазма – для выявления множества возбудителей – вирусов гепатита B, C, D, G, герпеса, ВИЧ, цитомегаловируса;
    • Моча и сок простаты – при диагностике ЗППП;
    • Мокрота, плевральная жидкость, бронхоальвеолярный лаваж – для диагностики легочных и внелёгочных форм туберкулеза;
    • Спинномозговая жидкость – для диагностики инфекций нервной системы;
    • Околоплодная жидкость – для определения внутриутробных заражений;
    • Мазок из зева – для выявления возбудителей инфекционного мононуклеоза и дифтерии;
      соскобы и мазки со слизистых для диагностики ЗППП;
      клетки слизистой желудка и желудочный сок — для выявления бактерии хеликобактер, вызывающей гастрит и язву.

    При одном взятии материала можно обнаружить сразу нескольких возбудителей, попавших в организм. Такая универсальность избавляет пациента от дополнительных обследований и лишних трат.

    Обнаружить и идентифицировать участки генетической информации удается при помощи специальных эталонных маркеров ДНК (праймеров) созданных для каждого известного возбудителя. Эталон позволяет найти «свой» фрагмент среди миллионов других. Если это происходит, запускается реакция полимеразной цепи.

    пцр анализ

    ПЦР—реакция делает огромное число копий выявленного участка генной информации (репликацию). Важно, что реплицируются только участки ДНК и РНК, необходимые для проведения анализа. Поэтому так важны чистота эксперимента и умение персонала обращаться с аппаратурой и образцами.

    Цепная реакция протекает очень быстро, уже через два часа участок ДНК увеличивается в миллионы раз, что позволяет обнаружить и точно идентифицировать инфекцию. Для работы с эталонами пробирки помещают в специальный прибор. При помощи программы задается алгоритм, несколько раз меняющий температуру среды и влияющий на протекание реакции. Результат ПЦР виден сразу после окончания исследования.

    Как расшифровать ПЦР анализ

    Проведение ПЦР исследования позволяет не просто установить тип инфекции, присутствующий в организме больного, но и оценить его с количественной точки зрения (количество микробов). Расшифровка результатов количественного анализа ПЦР играет важную роль в обнаружении и проверке эффективности лечения большого числа хронических заболеваний, скажем гепатита C.

    Результатом анализа ПЦР могут стать положительный и отрицательный ответы.

    • Отрицательный результат. Следы инфекции не были выявлены в биологическом материале, который являлся объектом исследования в процессе анализа ПЦР. Как правило, на основании отрицательного результата можно полагать, что в организме действительно отсутствует инфекция.
    • Положительный результат. Такой результат анализа ПЦР свидетельствует о том, что следы инфекционного заболевания присутствуют в биологическом материале пациента. Положительный результат анализа ПЦР характеризуется большой степенью точности.

    Иногда инфицирование выявляется на фоне полного здоровья и отсутствия признаков заболевания. Некоторые больные считают, что анализ сделан неправильно, но реальная ситуация другая. Если ПЦР показала, что возбудитель в организме есть, значит, он там действительно находится. Просто инфекционные болезни никогда не начинаются сразу после заражения, имея инкубационный период различной продолжительности.

    Скрытый период может продолжаться очень долго, например, при СПИДе – несколько лет, пока какие-то механизмы не подтолкнут вирусы к размножению. Возбудитель определяется в организме носителей и тех, кто не долечился. Очень часто переходят в скрытую (латентную) форму различные ЗППП. В этом случае может понадобиться дополнительная лабораторная диагностика.

    Точность расшифровки результатов ПЦР анализа

    Метод ПЦР, позволяющий выявлять достаточно большое число инфекций, характеризуется повышенной точностью, чувствительностью и специфичностью. Эти характеристики говорят о том, что с помощью исследования ПЦР можно:

    • Максимально точно установить отсутствие или присутствие инфекционного возбудителя.
    • Максимально точно определить конкретную разновидность инфекционного возбудителя (специфичность).
    • Выявить инфекцию даже в том случае, когда она имеет скрытый характер. Речь идет о низком уровне присутствия в подвергаемом исследованию биологическом материале пациента ДНК микробов (чувствительность).

    Преимущества метода ПЦР над иммуноферментным анализом и прочими иммунологическими инструментами выявления инфекции заключается в том, что он реже дает ошибочные результаты. То есть расшифровка анализа ПЦР значительно реже показывает отсутствие инфекционных микробов, если они есть в организме больного.

    Кроме того, почти не бывает, чтобы расшифровка анализа выявляла наличие в организме несуществующей инфекции, то есть давала ложноположительные результаты.Разумеется, стопроцентно правильными результаты ПЦР назвать все же нельзя, поэтому необходимо обязательно дополнять это исследование другими методиками.

    ПЦР-тест — что это такое простыми словами, что показывает ПЦР анализ и когда назначается

    ПЦР расшифровывается как «полимеразная цепная реакция». Это метод лабораторной диагностики, цель которого заключается в выявлении возбудителя инфекционного заболевания. Он является золотым стандартом в диагностике возбудителей, который был многократно проверен. ПЦР дает возможность определить патогенный микроорганизм даже в том случае, если в исследуемом материале присутствует всего несколько его молекул ДНК.

    Как работает ПЦР-анализ?

    Практически все живые существа на планете, исключая некоторые вирусы с РНК-геномами, имеют генетический материал, представленный длинной двухцепочной молекулой ДНК. Цепочка ДНК включает нуклеотиды — небольшие молекулы с универсальным строением. Они могут идти в цепочке ДНК в разном порядке. В зависимости от этого «собираются» разные геномы.

    У каждого болезнетворного микроорганизма есть свой, уникальный порядок построения цепочки ДНК, поэтому его невозможно спутать с ДНК человека.

    При проведении теста ПЦР используют фрагмент чужеродного генетического материала, добытый из образца, и размножают много раз с помощью белка-фермента. За несколько часов количество копий увеличивается в несколько миллиардов раз. Это позволяет получить такое количество ДНК, которого достаточно для успешного определения его природы.

    В лабораториях используют определенный набор реактивов для каждого конкретного микроорганизма, поэтому пациентам назначают не общий ПЦР-анализ, а тест на конкретный микроорганизм (например, на вирус гепатита С).

    Полимеразная цепная реакция проводится качественно и количественно. Качественный тест позволяет определить, есть ли в образце генетический материал микроорганизма (вируса или бактерии), который ищет врач. Количественный тест дает информацию о том, в каком количестве содержится материал.

    Преимущества ПЦР-анализа

    К достоинствам этого диагностического метода относят:

    1. Универсальность. ПЦР-тест обнаруживает любые ДНК и РНК, даже в тех случаях, если другие диагностические методы не дали результата.
    2. Эффективность. Полимеразная цепная реакция позволяет диагностировать некультивируемые, трудно культивируемые и латентно существующие формы патогенных микроорганизмов.
    3. Высокую чувствительность. Даже если в исследуемом материале присутствует всего один фрагмент генетического материала возбудителя, тест все равно показывает его.
    4. Высокую специфичность метода, достигающую 100%. В ходе диагностики выявляют уникальную последовательность нуклеотидов в цепочке ДНК, характерную только для конкретного патогенного микроорганизма, провоцирующего развитие заболевания.
    5. Высокую скорость выполнения. Для установки реакции достаточно несколько часов. Пациент получает результаты анализа на следующий день после сдачи.

    ПЦР-тест направлен на определение возбудителя заболевания, а не на реакцию на его проникновение со стороны организма.

    Показания к проведению ПЦР-теста

    Анализ проводят при инфекционных заболеваниях для определения природы их возбудителя. Также его назначают при:

    • необходимости точно установить конкретный болезнетворный микроорганизм;
    • диагностике лейкоза и других злокачественных новообразований;
    • диагностике некоторых генетически обусловленных заболеваний;
    • исследовании образцов биопсии, которые невозможно изучить с помощью других методов.

    С помощью ПЦР-анализа выявляют различные заболевания:

    • инфекционные (ВИЧ, гепатит, ТОРЧ-инфекции и т.д.);
    • передающиеся половым путем (хламидии, микоплазмы, кандиды);
    • внутриутробные инфекции (вирусы краснухи, герпеса, токсоплазмы);
    • респираторные (в настоящее время ПЦР-тест является золотым стандартом в диагностике вируса Ковид-19);
    • генетические.

    С помощью ПЦР можно провести тест на определение отцовства.

    Типы ПЦР

    Диагностика на основе полимеразной цепной реакции имеет несколько разновидностей. Она может быть:

    • инвертированной;
    • с обратной транскрипцией;
    • количественной;
    • вложенной;
    • ступенчатой.

    Наиболее надежный метод — ПЦР в режиме реального времени. Это количественный или полуколичественный способ диагностики, который предусматривает постоянное наблюдение образца генетического материала датчиком. Последний регистрирует сигналы на каждом цикле реакции.

    Подготовка к анализу

    При подготовке к ПЦР-анализу нужно соблюдать несколько правил:

    1. За 10-14 дней до назначенного теста прекратить прием любых препаратов и отказаться от проведения лечебных процедур, включая физиотерапевтические. Если прием лекарственных средств жизненно необходим, об этом нужно предупредить врача заранее.
    2. В случае забора мазка на выявление заболеваний, передающихся половым путем, нужно в течение суток перед исследованием отказаться от спринцеваний, использования тампонов и лечебных суппозиториев, применения антисептических средств. Также в этот период необходимо воздерживаться от половых актов. За 2 часа до забора мазка нельзя мочиться.
    3. Если выполняется забор мазка из зева, за 3 часа до анализа нельзя чистить зубы, пить, полоскать рот (даже простой водой).
    4. За трое суток до сдачи материала на ПЦР-исследование нужно полностью отказаться от употребления алкоголя.
    5. За двое суток до проведения теста нужно исключить повышенные физические нагрузки.

    Материалы для ПЦР-анализа

    В зависимости от направленности теста ПЦР, в качестве материала для исследования используют:

    • кровь (сыворотка или плазма);
    • соскобы эпителиальных клеток (с кожных покровов, слизистой оболочки уретры, цервикального канала);
    • различные биологические жидкости (околоплодная, суставная, спинномозговая жидкости, секрет предстательной железы);
    • мазок из зева;
    • различные биологические выделения (слюна, моча, мокрота);
    • биоптат (материал, полученный путем проведения биопсии).

    Расшифровка результатов ПЦР-тестирования

    Результат ПЦР-анализа либо положительный, либо отрицательный. Положительный указывает на то, что у человека присутствуют фрагменты ДНК возбудителя заболевания, то есть, что человек заражен и ему необходимо лечение. Отрицательный результат ПЦР-анализа свидетельствует об отсутствии следов ДНК патогена. В таком случае человек здоров.

    В некоторых случаях ПЦР-тест дает положительный результат, хотя человек не ощущает недомогания и специфических симптомов заражения. Это значит, что заболевание выявлено на ранней стадии развития. Для уточнения диагноза назначают дополнительные исследования, а затем, с учетом их результата, начинают курс лечения.

    Типы ПЦР анализа

    Представляет собой метод, используемый для экспоненциальной амплификации определенной последовательности ДНК-мишени.

    Позволяющей изолировать, секвенировать или клонировать одну РНК среди многих.

    ПЦР была разработана более 30 лет назад, американским биохимиком Кэри Муллисом.

    различные типы ПЦР

    Полимеразная реакция имеет широкое использование, применяется не только как анализ на ИППП.

    Применение ПЦР практикуется в следующих направлениях: генотипирование:

    • клонирование
    • обнаружение мутаций
    • секвенирование
    • криминалистика
    • тестирование на отцовство

    Как правило, ПЦР представляет собой трехступенчатую реакцию.

    Образец, содержащий разбавленную концентрацию матричной ДНК, смешивают с термостабильной ДНК-полимеразой.

    Такой как Taq-полимераза, праймер, дезоксинуклеотидтрифосфаты (dNTP) и магний.

    На первой стадии ПЦР образец нагревают до 95-98 градусов.

    На втором этапе температуру снижают до приблизительно 55-65 градусов.

    На третьей стадии температуру обычно повышают до 72 градусов.

    Эта последовательность денатурации, отжига, и расширения повторяется для множества циклов.

    Что и приводит к экспоненциальному усилению матричной ДНК.

    ПЦР достаточно сложный, но информативный метод исследования.

    Зачастую применяется в диагностике патологий вирусной и инфекционной этиологии.

    Анализ позволят практически со 100% точностью выявить и определить разновидность патогенного микроорганизма.

    В последнее время, полимеразная реакция приобрела популярность в ранней диагностике туберкулеза.

    Позволяет выявить возбудителя с 98% точностью на доклинической стадии.

    микобактерии туберкулеза

    Преимущества диагностики туберкулеза при помощи ПЦР:

    • Максимально высокая точность обнаружения присутствия в организме Mycobacterium tuberculosis, за счет использования специального фермента, предназначенного для возбудителя туберкулеза.
    • Высокая чувствительность анализа, как следствие, исследование способно обнаружить присутствие даже одной бактерии.
    • Быстрота получения результатов диагностики. Тестирование проводится достаточно быстро, уже спустя 3-5 часов можно получить готовые результаты.

    Mycobacterium tuberculosis является внутриклеточным микобактериальным патогеном.

    Представляет собой одно из самых распространенных и наиболее серьезных инфекционных заболеваний в мире.

    Считается, что более 2 миллиардов людей имеют скрытую инфекцию M. Tuberculosis.

    Около 8 миллионов — активную форму туберкулеза.

    Кроме того, пациенты с ВИЧ и нарушением работы иммунитета на фоне заболевания чаще подвержены дополнительному инфицированию бактерией M. tuberculosis.

    В их случае патология протекает сложнее, с многочисленными осложнениями.

    ПЦР при подозрении на туберкулез является наиболее востребованным и точным анализом.

    Способен выявить заболевание на самых ранних сроках, а также прибегнуть к своевременному, эффективному лечению.

    Качественный ПЦР на гепатит С

    В большинстве случаев, качественный ПЦР назначается при выявлении в организме пациента антител к гепатиту С.

    возбудитель вирусного гепатита

    Полимеразная реакция при подозрении на гепатит С проводится по следующему принципу.

    Первое тестирование — на четвертую неделю после обнаружения антител.

    Второе — на двенадцатую неделю, третье — на двадцать четвертую.

    Далее анализ назначается на постоянной основе, один раз каждые 12 месяцев.

    Проведение полимеразной реакции на гепатит Б, А, Ц позволяет получить максимально точные результаты за счет высокой чувствительности теста от 10 до 500 МЕ/мл.

    Это дает возможность определять наиболее низкие показатели присутствия в организме вируса и контролировать его дальнейшее развитие.

    Расшифровка результатов проводится лечащим врачом.

    Положительный анализ говорить о наличии патогенного микроорганизма.

    Отрицательный — чаще об отсутствии, но на 100% не исключает НСV.

    Взятие анализа на проведение ПЦР НСV проводится в утреннее время, биологическим материалом является венозная кровь.

    ПЦР количественный на гепатит С

    Количественная полимеразная реакция назначается пациентам, уже имеющим диагноз «гепатит С».

    Задача анализа выявить вирусную нагрузку на организм.

    Определить количественное присутствие патогена, а также понять, насколько проводимая терапия эффективна.

    Расшифровать результаты диагностического исследования поможет лечащей врач-гепатолог.

    Типы ПЦР анализов
    рассказывает подполковник
    медицинской службы, врач
    Ленкин Сергей Геннадьевич

    Содержание данной статьи проверено и подтверждено на соответствие медицинским
    стандартам врачем дерматовенерологом, урологом, к.м.н.

    Ленкиным Сергеем Геннадьевичем

    НаименованиеСрокЦена
    Прием венеролога900.00 руб.
    ДНК Mycoplasma hominis1 д.300.00 руб.
    ДНК Neisseria gonorrhoeae1 д.300.00 руб.
    ДНК Trichomonas vaginalis1 д.300.00 руб.

    ПЦР качественный или количественный: что лучше, в чем отличие

    Полимеразная реакция основана на обнаружении РНК возбудителя, проводится в двух вариантах — количественный и качественный метод.

    Real time PCR

    В чем отличие проводимых способов диагностики?

    Качественное исследование направлено на обнаружение патогенной микрофлоры в организме человека.

    Результаты анализов будут содержать два варианта ответа: положительный, отрицательный.

    В положительном случае — инфекция присутствует, в отрицательном — в организме ее нет.

    ПЦР количественного типа определяет вирусную нагрузку на организм и количество патогенного микроорганизма на 1 мл крови.

    Как правило, количественный ПЦР назначается пациентам, имеющим какое-либо заболевание.

    Как мониторинг течения патологии или для определения эффективности терапии.

    Разновидности ПЦР

    Основные используемые методики и разновидности полимеразной реакции:

    Разновидность полимеразной реакции

    Описание метода

    Вложенная ПЦР представляет собой модификацию ПЦР, которая была разработана для повышения чувствительности и специфичности. Вложенная ПЦР включает использование двух наборов праймеров и двух последовательных реакций ПЦР. Вложенная ПЦР полезна для амплификации генов, присутствующих в малом количестве.

    Применяется в случае, когда имеется информация только о небольшом участке внутри необходимой последовательности. Обычная полимеразная реакция требует, чтобы ДНК-последовательности на обоих концах области, подлежащей амплификации, были известны. Инверсная ПЦР (IPCR) и фиксированная данного условия не требует. IPCR усиливает фланкирующие неизвестные последовательности ДНК, используя обратную амплификацию и универсальный праймер.

    RT-PCR — это технология, посредством которой молекулы РНК превращаются в их комплементарные последовательности ДНК с помощью обратных транскриптаз, с последующей амплификацией, вновь синтезированной ДНК стандартными процедурами ПЦР. Обратная транскрипция ПЦР (RT-PCR) использует мРНК, а не ДНК в качестве исходного шаблона. Обычно используется для тестирования генетических заболеваний и для характеристики экспрессии генов в различных типах клеток.

    Суть метода заключается в использование праймеров с различной концентрацией. Анализ проводится с отжигом на высоких температурах, что позволяет поддерживать эффективность реакции на всех этапах лабораторного тестирования.

    (второе название метода:

    анализ в реальном времени)

    Система ПЦР в реальном времени основана на обнаружении и количественном определении продукта полимеразной реакции (патогена). Метод предусматривает использование ДНК-зондов или флуоресцентный праймер.

    Это метод повышения специфичности ПЦР-реакций. При проведении анализа ПЦР использует программу циклирования, где температура отжига постепенно уменьшается. Вначале температура достигает свыше 75 градусов. Затем температуру отжига постепенно уменьшают до тех пор, пока она не достигнет расчетной температуры отжига праймеров или нескольких градусов ниже. Амплификацию затем продолжают с использованием уже достигнутой, оптимальной температуры.

    Метод предполагает использование более одной пары праймеров. Цель мультиплексной ПЦР состоит в том, чтобы одновременно амплифицировать несколько сегментов ДНК-мишени, и тем самым, сохранять матричную ДНК, сэкономить время и минимизировать затраты на тестирование. Часто используется для генетического скрининга, где необходимо амплифицировать несколько продуктов за одну реакцию.

    Real – time PCR

    Real – time PCR (qRT-PCR) или количественная полимеразная реакция.

    Это современный метод исследования, направленный на измерение количества ДНК определенного микроорганизма.

    В ходе исследования проводится измерение количества уже амплифицированной ДНК в режиме real-time после каждого процесса (цикла) амплификации.

    Есть основное преимущество qRT-PCR (rt- pcr) по отношению к другим методикам полимеразной реакции.

    проведение ПЦР-диагностики

    Real-time PCR позволяет определить начальное количество копий матричной ДНК с максимальной точностью и высокой чувствительностью.

    Кроме того, данные qPCR в режиме реального времени могут быть оценены без гель-электрофореза.

    Это приводит к сокращению времени работы сканера и увеличению пропускной способности.

    Выполняется тестирование в единой, закрытой трубчатой системе qPCR.

    Поэтому возможность проникновения постороннего ДНК сведена к нулю.

    RAPD-ПЦР: в каких случаях используется

    Метод RAPD-ПЦР используется при необходимости идентифицировать конкретный патоген, среди изолятов близкородственных штаммов.

    Для проведения исследования требуется тщательная очистка диагностируемого ДНК.

    В других методиках ПЦР, которые были упомянуты ранее, предполагается использование нескольких праймеров.

    При RAPD- исследовании проводится отжиг только одного, комплементарного, со случайным участком ДНК диагностируемой бактерии.

    В ходе анализа подбираются оптимальные условия (отжиг, праймер, температура).

    Это позволяет добиться хороших результатов для определения конкретного патогена среди схожих.

    ПЦР с обратной транскрипцией

    Основные используемые методики полимеразной реакции–вложенная, инвертированная, асимметричная, ступенчатая, виртуальная.

    Существует еще один метод диагностики патогенов–RT-PCR.

    Для амплификации РНК-мишеней была разработана ПЦР-диагностика с обратной транскрипцией.

    Чаще всего исследование применяется с целью выявления патогенной флоры, провоцирующей ВИЧ, грипп и ВПЧ.

    Способ влечет за собой начальную стадию транскрибирования части генома РНК в комплементарную ДНК.

    Которая затем амплифицируется с помощью ПЦР.

    лаборант с ПЦР-амплификатором

    Процесс RT-PCR:

    • После того, как РНК выделяется из клеточного материала путем экстракции, к реакционной смеси добавляют специальное вещество, которое содержит фермент обратной транскриптазы, а также праймеры, специфичные для интересующей мишени, и нуклеотиды. Если мишень присутствует, происходит обжигание цепи РНК при помощи праймеров.
    • Фермент обратной транскриптазы синтезирует комплементарную нить ДНК, простирающуюся от праймера.
    • Температуру повышают до 95 градусов и цепи РНК / ДНК отделяются.
    • Затем происходит снижение температуры, что позволяет праймерам отжигать вновь образованную ДНК.

    RT-PCR может выполняться как одно- или двухступенчатая процедура.

    ПЦР на герпес 6 типа

    Вирус герпеса 6 типа относится к роду герпесвирусов, состоит из двух подтипов — HHV6А и 6В.

    вирус герпеса

    Первый подтип поражает ткани нервной системы.

    Нередко является провоцирующим фактором в развитии рассеянного склероза.

    Второй часто проявляется сыпью и признаками краснухи.

    Для выявления вирусной патологии герпеса 6 типа применяется ПЦР в реальном времени.

    В некоторых случаях врач может рекомендовать диагностику герпеса 1 и 2 типа — наиболее распространенных и 16, 18 типа — провоцирующих злокачественные процессы.

    Интерпретация анализа, как правило, следующая: положительный или отрицательный результат.

Ссылка на основную публикацию